內(nèi)標法是一種間接或相對的校準方法。在分析測定樣品中某組分含量時，加入一種內(nèi)標物質以校誰和消除出于操作條件的波動而對分析結果產(chǎn)生的影響，以提高分析結果的準確度。
內(nèi)標法在氣相色譜定量分析中是一種重要的技術。使用內(nèi)標法時，在樣品中加入一定量的標準物質，它可被色譜拄所分離，又不受試樣中其它組分峰的干擾，只要測定內(nèi)標物和待測組分的峰面積與相對響應值，即可求出待測組分在樣品中的百分含量。采用內(nèi)標法定量時，內(nèi)標物的選擇是一項十分重要的工作。理想地說，內(nèi)標物應當是一個能得到純樣的己知化合物，這樣它能以準確、已知的量加到樣品中去，它應當和被分析的樣品組分有基本相同或盡可能一致的物理化學性質(如化學結構、極性、揮發(fā)度及在溶劑中的溶解度等)、色譜行為和響應特征，最好是被分析物質的一個同系物。當然，在色譜分析條什下，內(nèi)標物必須能與樣品中各組分充分分離。需要指出的是，在少數(shù)情況下，分析人員可能比較關心化臺物在一個復雜過程中所得到的回收率，此時，他可以使用一種在這種過程中很容易被完全回收的化臺物作內(nèi)標，來測定感興趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所說的選擇原則。
在使用內(nèi)標法定量時，有哪些因素會影響內(nèi)標和被測組分的峰高或峰面積的比值?
影響內(nèi)標和被測組分峰高或峰面積比值的因素主要有化學方面的、色譜方面的和儀器方面的三類。
由化學方面的原因產(chǎn)生的面積比的變化常常在分析重復樣品時出現(xiàn)。
化學方面的因素包括：
1、內(nèi)標物在樣品里混合不好；
2、內(nèi)標物和樣品組分之間發(fā)生反應，
3、內(nèi)標物純度可變等。
對于一個比較成熟的方法來說，色譜方面的問題發(fā)生的可能性更大一些，色譜上常見的一些問題(如滲漏)對絕對面積的影響比較大，對面積比的影響則要小一些，但如果絕對面積的變化已大到足以使面積比發(fā)生顯著變化的程度，那么一定有某個重要的色譜問題存在，比如進樣量改變太大，樣品組分濃度和內(nèi)標濃度之間有很大的差別，檢測器非線性等。進樣量應足夠小并保持不變，這樣才不致于造成檢測器和積分裝置飽和。如果認為方法比較可靠，而色譜固看來也是正常的話，應著重檢查積分裝置和設置、斜率和峰寬定位。對積分裝置發(fā)生懷疑的最有力的證據(jù)是：面積比可變，而峰高比保持相對恒定，
在制作內(nèi)標標準曲線時應注意什么?
在用內(nèi)標法做色譜定量分析時，先配制一定重量比的被測組分和內(nèi)標樣品的混合物做色譜分析，測量峰面積，做重量比和面積比的關系曲線，此曲線即為標準曲線。在實際樣品分析時所采用的色譜條件應盡可能與制作標準曲線時所用的條件一致，因此，在制作標準曲線時，不僅要注明色譜條件(如固定相、柱溫、載氣流速等)，還應注明進樣體積和內(nèi)標物濃度。在制作內(nèi)標標準曲線時，各點并不完全落在直線上，此時應求出面積比和重量比的比值與其平均位的標準偏差，在使用過程中應定期進行單點校正，若所得值與平均值的偏差小于2，曲線仍可使用，若大于2，則應重作曲線，如果曲線在鉸短時期內(nèi)即產(chǎn)生變動，則不宜使用內(nèi)標法定量。

外標法
用待測組分的純品作對照物質，以對照物質和樣品中待測組分的響應信號相比較進行定量的方法稱為外標法。此法可分為工作曲線法及外標一點法等。工作曲線法是用對照物質配制一系列濃度的對照品溶液確定工作曲線，求出斜率、截距。在完全相同的條件下，準確進樣與對照品溶液相同體積的樣品溶液，根據(jù)待測組分的信號，從標準曲線上查出其濃度，或用回歸方程計算，工作曲線法也可以用外標二點法代替。通常截距應為零，若不等于零說明存在系統(tǒng)誤差。工作曲線的截距為零時，可用外標一點法(直接比較法)定量。
外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣，測得峰面積的平均值，用下式計算樣品中i組分的量：
　　　　　W＝A(W)／(A)　　　　　　
式中W與A分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰面積。(W)及(A)分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰面積。外標法方法簡便，不需用校正因子，不論樣品中其他組分是否出峰，均可對待測組分定量。但此法的準確性受進樣重復性和實驗條件穩(wěn)定性的影響。此外，為了降低外標一點法的實驗誤差，應盡量使配制的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。　
外標法 external standard method
色譜分析中的一種定量方法，它不是把標準物質加入到被測樣品中，而是在與被測樣品相同的色譜條件下單獨測定，把得到的色譜峰面積與被測組分的色譜峰面積進行比較求得被測組分的含量。外標物與被測組分同為一種物質但要求它有一定的純度，分析時外標物的濃度應與被測物濃度相接近，以利于定量分析的準確性。
定量分析中怎樣選擇內(nèi)標法或外標法
選一與欲測組分相近但能完全分離的組分做內(nèi)標物（當然是樣品中沒有的組分），然后配制欲測組分和內(nèi)標物的混合標準溶液，進樣得相對校正因子。再將內(nèi)標物加入欲測組分的樣品中，進樣后測得欲測組分和內(nèi)標物的定量參數(shù)。用內(nèi)標法公式計算即可。

內(nèi)標法是將一定量的純物質作內(nèi)標物，加入到準確稱量的試樣中，根據(jù)被測試樣和內(nèi)標物的質量比及其相應的色譜峰面積之比，來計算被測組分的含量。
選擇內(nèi)標物有4個要求：1.內(nèi)標物應是該試樣中不存在的純物質；2.它必須完全溶于試樣中，并與試樣中各組分的色譜峰能完全分離；3.加入內(nèi)標物的量應接近于被測組分；4.色譜峰的位置應與被測組分的色譜峰的位置相近，或在幾個被測組分色譜峰中間。
內(nèi)標法的優(yōu)點是測定的結果較為準確，由于通過測量內(nèi)標物及被測組分的峰面積的相對值來進行計算的，因而在一定程度上消除了操作條件等的變化所引起的誤差。內(nèi)標法的缺點是操作程序較為麻煩，每次分析時內(nèi)標物和試樣都要準確稱量，有時尋找合適的內(nèi)標物也有困難。
外標法簡便，但進樣量要求十分準確，要嚴格控制在與標準物相同的操作條件下進行，否則造成分析誤差，得不到準確的測量結果。
內(nèi)標與外標都是定量的一種方法而已，至于哪一種方法好與不好不能一概而論，做不同的分析，面對著不同的要求，再加上分析成本分析效率等等問題，我想簡單而有效進行定量分析來滿足要求才是最重要的。
1、以前做過很多醫(yī)藥、農(nóng)藥中間體的芳香族鹵代化合物的常量定量分析，沒有自動進樣器，用外標法定量，確實重現(xiàn)性與穩(wěn)定性非常差，結果經(jīng)常受到搞合成同事的質疑。其實，仔細分析原因不一定就是外標法不適合這種定量分析，首先我們的實驗室儀器和手段是否調(diào)整到一種穩(wěn)定而合理的狀態(tài)了，比如，襯管是否潔凈，玻璃棉的位置是否合適恰當（能否使樣品盡可能的汽化）、汽化溫度是否合適、色譜峰形是否對稱（也就是樣品與色譜柱健合相是否匹配）、附近有沒有其它色譜峰的干擾、選用什么進樣方式（如快速進樣還是熱針進樣）等等因素的影響都需要考慮，如果這些因素都考慮了，按照GMP方法驗證對于精密度的要求，同一樣品進6針以上的RSD和配制6個樣品的定量結果RSD都能滿足小于1.5%的要求，那么這個方法用外標法就是完全適用的，但是前面的影響因素是一定要都考慮到的，否則談論這個方法是否適用就有失偏頗了。在做過的許多出口產(chǎn)品的定量分析方法當中有許多是一些醫(yī)藥公司提供的比較完善而驗證過的方法，內(nèi)標與外標都有（他們用的都是自動進樣）精密度都能滿足RSD小于1.5%的要求，當一個方法能夠滿足測試要求的時候，無論內(nèi)標外標，都是可行的，當然有一個分析成本和分析時間的問題，內(nèi)標的成本和控制溶液、樣品溶液的配制當然要比外標要高和麻煩一些了。而有些時候，可能受你實驗室現(xiàn)有儀器和附屬設備的影響，達不到一定的要求，而還必須進行定量分析，有時外標的結果可能就要差一些，這時，你可能就要考慮用內(nèi)標法了，可以排除手動進樣的誤差、分流歧視的影響、包括一些未知因素平行誤差的影響，這時內(nèi)標可能就顯示出它的優(yōu)勢來了。
2、上面已經(jīng)提到當做方法驗證的時候，當同一樣品配制6個樣品溶液用所選用的外標法進行定量的時候，RSD都滿足1.5%的要求時，也分為兩種情況，小于1%和大于1%小于1.5%。如果RSD的結果小于1%，那這個方法就沒有什么可以懷疑的了；如果RSD的結果大于1%而在1.5%略低一些的范圍活動時，這個方法的可行性就將受到質疑，畢竟這是方法驗證，你就要考慮上面1所提到的影響因素的影響了，如果排除掉以上的影響因素，RSD還是在1.5%附近，就要嘗試內(nèi)標了，如果內(nèi)標結果的RSD很好，就證明你的這個方法受實驗條件的影響很大，只能用內(nèi)標了，或者干脆將原方法做大的變動，再嘗試用外標法測試。
3、而對于微量分析，比如農(nóng)藥和獸藥殘留的分析、環(huán)境分析等，根據(jù)不同的限量標準要求對于精密度的要求也比常量分析的要求要寬松的多，RSD有時可以允許達到10%甚至更高，這時可能外標法有更大的應用空間。
4、單從精密度方面去考慮，排除其它成本和效率的因素，個人認為還是內(nèi)標優(yōu)于外標。曾經(jīng)做過一個中間體二氨基丙醇的常量定量分析，以二乙醇胺為內(nèi)標，RTX-5
amine（堿改性）
15m*0.32mm*1.0um色譜柱分析，將配制好的控制溶液（含有內(nèi)標物）自動進樣器進6針，目的物（二氨基丙醇）與內(nèi)標物（二乙醇胺）峰面積比率的RSD為0.18%，而只對這六針樣品的目的物峰（二氨基丙醇）面積求RSD，結果為0.71%，通過這一實例的結果大家就會發(fā)現(xiàn)到底哪個方法精密度更好了，當然是內(nèi)標更好了。當然這個化合物的檢測方法最后根據(jù)上面的驗證數(shù)據(jù)用內(nèi)標和外標定量都是可以的，實驗室可以自由選擇。但內(nèi)標與外標精密度結果的差異是顯然存在的事實。
結論：應用外標法能夠滿足要求，****還是外標法了，畢竟簡單而省事。對于精密度要求比較高、結果準確度會產(chǎn)生重大影響、實驗室條件不是很理想的等等條件下，用內(nèi)標法還是必要的。無論應用那種方法，方法的驗證和確認都是很重要的，只要是按照程序經(jīng)過驗證和確認的方法，都有其應用的空間的。
外標法
用被測化合物的純品作為標準樣品，配制成一系列的已知濃度的標樣。
注入色譜柱的到其響應值（峰面積）。
在一定范圍內(nèi)，標樣的濃度與響應值之間存在較好的線性關系，即W=f×A，制成標準曲線。
在完全相同的實驗條件下，注入未知樣品，得到欲測組分的響應值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測組分的濃度。
外標法的優(yōu)點：
操作、計算簡單，是一種常用的定量方法。
無需各組分都被檢出、洗脫。
需要標樣。
標樣及未知樣品的測定條件要一致。
進樣體積要準確。
內(nèi)標法操作：
將已知量的內(nèi)標樣加入標準樣品，制成混合標樣，并配制一系列的已知濃度的工作標樣�；旌蠘藰又袠藰优c內(nèi)標樣的摩爾比不變。
注入色譜柱，以（標樣峰面積/內(nèi)標樣峰面積）為響應值。
根據(jù)響應值與工作標樣濃度之間存在的線性關系，即W=f×A，制成標準曲線。
將已知量的內(nèi)標樣加入未知樣品，注入色譜柱，得到欲測組分的響應值。
根據(jù)已知的系數(shù)f，即可求出欲測組分的濃度。
內(nèi)標法的特點：
操作過程中樣品和內(nèi)標是混合在一起注入色譜柱的，因此只要混合溶液中被測組分與內(nèi)標的量的比值恒定，上樣體積的變化不會影響影響定量結果。
內(nèi)標法抵消了上樣體積，乃至流動相、檢測器的影響，因此比外標法精確。